帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是一種發(fā)生于人類中老年中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疾病，動(dòng)物并不自然發(fā)生該病。給動(dòng)物使用不同的神經(jīng)毒素如6-羥基多已胺。甲基安非他明、1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫砒啶（MPTP）以及Fe2可模擬出該病的某些特征。PD的運(yùn)動(dòng)癥狀和相應(yīng)的病理變化可在動(dòng)物如小鼠、大鼠、靈長類等觀察到，大量的研究表明，中腦雙側(cè)蒼白球和黑質(zhì)DA能神經(jīng)元壞死是PD的主要病理學(xué)改變。
 
1957年，Carlsson等首先描述了利血平可耗竭兒茶酚胺和5-羥色胺，并導(dǎo)致小鼠運(yùn)動(dòng)障礙。這種改變可被左旋多巴(L-dopa)拮抗，標(biāo)志著第一個(gè)PD動(dòng)物模型的建立。所有這些觀察對(duì)于理解PD基底核多巴胺神經(jīng)元的破壞和多巴胺（dopamine，DA）的耗竭做出了重要貢獻(xiàn)，從而奠定了左旋多巴治療PD的基礎(chǔ)。
 
PD是為數(shù)不多的已經(jīng)建立了較好的動(dòng)物模型的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一。這些模型對(duì)于理解PD的發(fā)病機(jī)制、尋找新的抗PD藥物做出了巨大的貢獻(xiàn)。再合適的動(dòng)物模型也不可能等同于人類的PD，但利用一個(gè)合適的動(dòng)物模型，人們能夠：（1）篩選出可*的、新的、作用強(qiáng)的藥物：（2）闡明這些藥物的作用機(jī)制：（3）闡明人類相應(yīng)疾病的病理生理機(jī)制。下面簡單介紹幾種最重要的PD在體（in vivo）模型。
 
一、6－羥基多巴胺（6-hydroxydopamine，6-OHDA）模型
（一）6-OHDA及其動(dòng)物模型簡介
最常用的是大鼠6-OHDA模型。6-OHDA是第一個(gè)選擇性破壞兒茶酚胺神經(jīng)系統(tǒng)的工具藥。當(dāng)6-OHDA局部注射到黑質(zhì)或紋狀體后，某些胺類攝取系統(tǒng)誤將它作為內(nèi)源性兒茶酚胺（DA、去甲腎上腺素）來利用（Sachs ＆ Jonsson l975）。
 
1．神經(jīng)病理和神經(jīng)化學(xué)變化
 
神經(jīng)毒素6-OHDA的作用是在研究自主神經(jīng)系統(tǒng)時(shí)首次發(fā)現(xiàn)的。在自主神經(jīng)系統(tǒng)中，6-OHDA可引起長達(dá)幾個(gè)月的去甲腎上腺素的耗竭并選擇性破壞去甲腎上腺素能神經(jīng)末梢。外周給6-OHDA不能通過血腦屏障，而腦室內(nèi)或腦實(shí)質(zhì)內(nèi)給小劑量的6-OHDA （150ug或8ug）會(huì)引起兒茶酚胺能神經(jīng)元的選擇性破壞，耗竭受損腦區(qū)的DA、腎上腺素和去甲腎上腺素，而其它神經(jīng)遞質(zhì)的濃度并不改變。另外，進(jìn)一步的生物化學(xué)和組織化學(xué)變化如幾茶酚胺代謝產(chǎn)物減少、四氫吡啶（TH的輔助因子）減少。突觸前膜再攝取兒茶酚胺的位點(diǎn)數(shù)目減少、TH免疫組化陽性反應(yīng)神經(jīng)元減少等，表明有兒茶酚胺能神經(jīng)元破壞。組織化學(xué)研究證實(shí)了6-OHDA對(duì)兒茶酚胺能神經(jīng)元毒性作用的特異性。同時(shí)應(yīng)用去甲腎上腺素高親和力轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的抑制劑（如去甲丙咪嗪）可某種程度改變這種特異性，使損傷局限在DA能神經(jīng)元。
 
2．單側(cè)損毀后的行為學(xué)變化
因?yàn)?-OHDA并不能透過血腦屏障，所以它必須是腦室內(nèi)或腦內(nèi)直接注射。將6-OHDA注射到黑質(zhì)致密部或紋狀體，能產(chǎn)生DA能神經(jīng)細(xì)胞的選擇性的和永久性的破壞。若雙側(cè)黑質(zhì)破壞，動(dòng)物不僅運(yùn)動(dòng)障礙，而且出現(xiàn)吞咽困難和不渴癥，不得不人工胃管飼養(yǎng)來維持動(dòng)物生存。
 
大鼠單側(cè)紋狀體或黑質(zhì)內(nèi)注6-OHDA，引起同側(cè)DA能神經(jīng)元的廣泛死亡及紋狀體內(nèi)DA的耗竭，現(xiàn)已成為PD研究的常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型（During等，1992）。此模型在用藥后2周左右即可出現(xiàn)不對(duì)稱運(yùn)動(dòng)行為。外周給下列藥物如DA受體激動(dòng)劑L-DOPA和促DA釋放劑等之后，身體縱軸出現(xiàn)明顯的不對(duì)稱表現(xiàn)并引發(fā)特征性的旋轉(zhuǎn)行為，此行為可被定量。卜DOPA和DA受體激動(dòng)劑如嗅隱亭能引起動(dòng)物向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)（未受損一側(cè)），而促DA釋放劑如安非他明（Ampheltamine，AMPH）和金剛烷胺引起動(dòng)物向同側(cè)旋轉(zhuǎn)（受損傷一側(cè)）。例如，DA減少90％以上的大鼠，腹腔注射阿樸嗎啡（Apomorphine，APO）1mg/kg后，向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)，4分鐘內(nèi)超過20圈（Hefti等， 1980）。
 
引起PD動(dòng)物慢性旋轉(zhuǎn)行為的可能機(jī)制是：（1）黑質(zhì)DA能神經(jīng)元變性引起紋狀體內(nèi)突觸后膜DA受體超敏。損毀側(cè)DA受體對(duì)激動(dòng)劑的敏感性比對(duì)側(cè)高。（2）促DA釋放劑可刺激未受損一側(cè)紋狀體內(nèi)的DA受體而不是損毀側(cè)的受體。（3）紋狀體的傳出纖維抑制同側(cè)的運(yùn)動(dòng)活動(dòng)，紋狀體內(nèi)DA受體興奮可抑制紋狀體傳出纖維的活動(dòng)。這樣， DA受體可增加運(yùn)動(dòng)活動(dòng)，如果直接使用DA受體激動(dòng)劑，受損側(cè)超敏的DA受體的反應(yīng)比健側(cè)強(qiáng)，引起損毀側(cè)更強(qiáng)的運(yùn)動(dòng)活動(dòng)，導(dǎo)致動(dòng)物向健側(cè)（對(duì)側(cè)）旋轉(zhuǎn)。另一方面，促DA釋放的藥物主要刺激健側(cè)DA受體，引起動(dòng)物向損毀側(cè)（同側(cè)）旋轉(zhuǎn)。這種旋轉(zhuǎn)行為可以明確區(qū)分某種藥物是激動(dòng)DA受體的還是引起DA釋放的，但不能區(qū)分兩種作用都有的藥物。
 
通過觀察和測(cè)量這種旋轉(zhuǎn)行為，或通過一種稱為“旋轉(zhuǎn)測(cè)量儀rotometer”的特殊裝置，很容易進(jìn)行計(jì)算。旋轉(zhuǎn)測(cè)量儀的應(yīng)用更方便了同時(shí)測(cè)量兒只動(dòng)物、計(jì)算機(jī)控制。作圖、統(tǒng)計(jì)分析。嗅隱亭（bromocriptine）和其它的DA激動(dòng)劑甚至L-多巴都能產(chǎn)生與APO相似的向健側(cè)旋轉(zhuǎn)行為，但它們?cè)谧饔玫某掷m(xù)時(shí)間、強(qiáng)度和效能方面有量的差別。
 
3．神經(jīng)毒作用的機(jī)制
 
因?yàn)?-OHDA與其它兒茶酚胺結(jié)構(gòu)類似，所以很容易被兒茶酚胺高親和力轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)到相應(yīng)的神經(jīng)元內(nèi)。這種假設(shè)可以解釋6-OHDA對(duì)兒茶酚胺能神經(jīng)元的特異性神經(jīng)毒作用。實(shí)際上己證實(shí)，大鼠單側(cè)紋狀體內(nèi)注射6-OHDA，同側(cè)黑質(zhì)內(nèi)TH免疫組化陽性反應(yīng)的神經(jīng)元數(shù)量明顯減少長達(dá)10個(gè)月（Ichitani等，1994）。6-OHDA通過產(chǎn)生H2O2和羥自由基損傷黑質(zhì)紋狀體DA能神經(jīng)元，據(jù)推測(cè)某些金屬如鐵產(chǎn)生過多可損傷神經(jīng)元。核磁共振、神經(jīng)化學(xué)、組織化學(xué)己證實(shí)，在6-OHDA損傷的大鼠紋狀體內(nèi)鐵增加。此外，6-OHDA引起體內(nèi)鐵蛋白釋放鐵增加。己有證據(jù)表明，黑質(zhì)內(nèi)注射Fe3+產(chǎn)生的神經(jīng)毒作用與注射6-OHDA相似，鐵可使H2O2產(chǎn)生羥自由基（Sengstock等， 1992）。 6-OHDA的神經(jīng)毒作用中還包括羥自由基的作用，間接證據(jù)是：
 
6-OHDA影響自由基清除系統(tǒng)，因此，6-OHDA不僅引起受染腦區(qū)谷胱甘肽（GsH）減少（紋狀體內(nèi)減少22％），而且引起SOD活性降低（紋狀體內(nèi)降低22％）。紋狀體注6-OHDA后ma1ondialdehyde水平和conjugated dienes水平分別增加43％和40％。最近發(fā)現(xiàn)6-OHDA對(duì)線粒體氧化呼吸鏈中復(fù)合物1的毒性比MPP+強(qiáng)（MPP+是MPTP產(chǎn)生神經(jīng)毒的活性形式）。MPP+抑制復(fù)合物I導(dǎo)致線粒體產(chǎn)生超氧自由基、H2O2和羥自由基。paraquat抑制復(fù)合物I也導(dǎo)致超氧自由基的形成。預(yù)先給鐵離子螫合劑、維生素E和單胺氧化酶B（MAO-B）抑制劑se1egiline可部分或全部防止6-OHDA和鐵的神經(jīng)毒作用，這也間接證明有自由基形成（Cleeter等， 1992： Perumal等， 1992；Glinka等，1995）。
 
（二)6-OHDA損毀建立“完全”損傷PD模型
1．制備PD大鼠模型用液體
 
稱1.8毫克6-OHDA，溶于含0.2％抗壞血酸的0.9％氯化鈉溶液600ul中（濃度為3mg/ml），分裝，-20℃避光保存，貯存不宜超過10天。使用時(shí)從-20℃中取出，置于冰上，避光，30分鐘內(nèi)用完。
 
2．操作步驟
 
Wistar大鼠，雌雄均可，體重200-250g。10％水合氯醛（4℃存放，不宜過久）3ml/kg，腹腔注射麻醉。約5分鐘動(dòng)物麻醉平穩(wěn)后，將動(dòng)物俯臥位固定于小動(dòng)物立體定位儀上。上耳桿時(shí)注意對(duì)稱和穩(wěn)固，上牙齒固定于門齒棒上，并用壓桿壓往鼻骨。剪去頭部頂毛，切開或剪開皮膚，范圍為：兩外耳道中線連線前后各0.5厘米。用眼科剪去除顱骨表面的結(jié)締組織膜或用手術(shù)刀刮去，以使顱骨表面盡可能干凈。少量出血時(shí)用于棉球壓迫止血。稍候干燥，可見到顱骨表面呈白色，前囟、后囟清晰可見。
 
將注射用的10ul或25ul Hamilton微量注射器固定于立體定位注射儀上顱骨正上方，準(zhǔn)備好牙科鉆頭，鉆頭直徑0.8m1。損毀部位為單側(cè)黑質(zhì)或內(nèi)側(cè)前腦束。以前囟為標(biāo)準(zhǔn)參考點(diǎn)，進(jìn)針點(diǎn)可選擇左側(cè)或右側(cè)。有時(shí)前囟不清晰，可分別按壓兩側(cè)的頂蓋骨和額骨，在“按壓一放松”的過程中，便可清晰見到前囟。依Paxson《The Rat Brain》圖譜，注射部位的坐標(biāo)為：第一點(diǎn)（mfb），門齒棒高于耳桿3.4mm。前囟后4.0mn1，中線左旁開0.8mm，顱骨表面下8.0mm：第二點(diǎn)（SNC），門齒棒低子耳桿2.3mm，前囟后4.l4mm，中線左旁開1.2mm，顱骨表面下7.8mm。用牙科鉆鉆開顱骨恰至軟腦膜表面。用小號(hào)針頭輕輕挑破軟腦膜。此時(shí)注意最好不要用鉆頭直接鉆破軟腦膜，以免大量出血。每點(diǎn)注射6-OHDA溶液4ul（12ug），注射速度為lul／min，留針10分鐘，縫合皮膚，將術(shù)后的大鼠置于安靜保溫處直至清醒，自由進(jìn)食飲水。
 
 3．模型檢測(cè)
 
（1）行為學(xué)檢測(cè)：依照國際通用的標(biāo)準(zhǔn)（Hudson等，1993），對(duì)注射過6-OHDA的大鼠，于術(shù)后第二周開始篩選。即每周一次腹腔注射APO（0.25mg／kg體重）誘導(dǎo)其向健側(cè)旋轉(zhuǎn)，共篩選3周，每次記錄30分鐘，旋轉(zhuǎn)210圈以上者為PD大鼠。
 
（2）病理學(xué)檢查：模型成功的動(dòng)物，10％水合氯醛過量麻醉，開胸，經(jīng)心臟從胸主動(dòng)脈滴入（或經(jīng)恒流泵輸入）0.1mol／L的磷酸緩沖液（pH7.3-7.4)）或l％的多聚甲醛（磷酸緩沖液配制）100-150m1，然后繼續(xù)輸入4％多聚甲醛（磷酸緩沖液配制）200ml以進(jìn)行內(nèi)固定。全腦取出后，繼續(xù)在4％多聚甲醛溶液中浸泡24小時(shí)以上進(jìn)行外固定。然后經(jīng)30％蔗糖置換后，OCT包埋，快速冰凍切片，片厚10um。常規(guī)病理學(xué)檢查，或進(jìn)行酪氨酸羥化酶（tyrosine droxylase，TH）的免疫組化染色，觀察DA神經(jīng)元的數(shù)目。可見損傷側(cè)黑質(zhì)致密部DA神經(jīng)元明顯缺失，膠質(zhì)細(xì)胞增生，殘留神經(jīng)細(xì)胞固縮，部分胞漿明顯腫脹和空泡變。同側(cè)紋狀體內(nèi)DA神經(jīng)元末梢的TH反應(yīng)性大為降低甚至消失。生理鹽水對(duì)照組上述部位DA神經(jīng)元與未受損側(cè)相比，無顯著差別。尾核、豆?fàn)詈丝蔁o明顯特異性改變。
 
（3）生化檢查：動(dòng)物迅速斷頭取腦，速凍至-70℃。采用立體定位方法穿刺得到損傷側(cè)與未損傷側(cè)紋狀體組織標(biāo)本（濕重大約0.3mg）。高效液相電化學(xué)法（HPLC-ECD）檢測(cè)中腦黑質(zhì)、紋狀體DA、高香草酸（HVA）和3，4-二羥基苯乙酸（DOPAC）的含量?？梢娛軗p側(cè)上述部位的DA、HVA、DOPAC含量均降低。
 
（4）實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法：旋轉(zhuǎn)行為及DA等含量測(cè)定結(jié)果采用配對(duì)，檢驗(yàn)。
 
（三）6-OHDA損毀建立部分損傷PD模型
1．低劑量6-OHDA內(nèi)側(cè)前腦束或黑質(zhì)注射
（1）操作步驟 Fisher大鼠，雄性，體重275g左右。腹腔注射水合氯醛麻醉后，按上述方法固定于腦立體定位儀上，切開皮膚，暴露前、后囟以確定注射部位。損毀內(nèi)側(cè)前腦束（MFB）者定位于前囟后4.0mm，中線旁開1.8mm，顱骨外表面下8.5mm：損毀黑質(zhì)吻側(cè)部者定位于前囟后5.0mn1，中線旁開2.0mm，顱骨外表面下7.5mm。注射6-OHDA劑量4ug，注射時(shí)間為1分鐘，留針5分鐘，然后慢慢退針（約2分鐘）?？p合皮膚后，將大鼠放口籠中。
（2）模型檢測(cè) 行為學(xué)檢測(cè)：術(shù)后第三周，將大鼠腹腔內(nèi)注射AMPH（5mg／kg），誘發(fā)大鼠向損傷側(cè)旋轉(zhuǎn)。于第四周，再次腹腔內(nèi)注射APO（0.05mg／kg），誘發(fā)大鼠向健側(cè)旋轉(zhuǎn)。用自動(dòng)旋轉(zhuǎn)測(cè)試儀計(jì)數(shù)每次藥物注入后90分鐘內(nèi)大鼠旋轉(zhuǎn)次數(shù)。將AMPH誘發(fā)旋轉(zhuǎn)大于200圈/小時(shí)，且APO誘發(fā)旋轉(zhuǎn)小于60圈/小時(shí)者，定為部分損傷大鼠模型。（F．Junn等，1994）
（3）其它檢測(cè) 病理學(xué)和生化檢測(cè)同“完全”損傷PD模型。
 
2．6-OHDA紋狀體內(nèi)注射
（1）操作步驟
 Sprague Dawley大鼠，雌性，體重225g左右，按上述方法麻醉，固定，暴露前囟。注射部位于左、右側(cè)紋狀體均可。定位參數(shù)以前囟和顱骨中線為參照。注射部位在前囟前1.0mm，中線旁開3.0mm，硬腦膜下4.5mm：注入6-OHDA劑量為20ug（溶解于3ul 0.9％的生理鹽水中并加入0.2mg／ml的抗壞血酸）。注射時(shí)間約3分鐘，留針3分鐘后慢慢退出。

（2）模型的檢測(cè)
旋轉(zhuǎn)行為檢測(cè)：術(shù)后一周，將大鼠腹腔內(nèi)注射AMPH（5mg／kg）誘發(fā)大鼠旋轉(zhuǎn)。計(jì)數(shù)90分鐘內(nèi)的旋轉(zhuǎn)次數(shù)。于第三周，皮下注射APO（0.25mg/kg），誘發(fā)大鼠向健側(cè)旋轉(zhuǎn)。計(jì)數(shù)40分鐘內(nèi)大鼠旋轉(zhuǎn)次數(shù)。AMPH誘發(fā)旋轉(zhuǎn)在3圈／分鐘者，可作為部分損傷PD模型。
 
邁步試驗(yàn)：選擇一個(gè)1.1米長，傾斜放置的木板，木板的一端連通鼠籠。試驗(yàn)開始前3天，先讓鼠對(duì)試驗(yàn)環(huán)境有所適應(yīng)，并設(shè)法訓(xùn)練大鼠慢慢爬回到籠中。試驗(yàn)開始后，實(shí)驗(yàn)者一只手固定大鼠雙后肢并輕輕上提，使其離開桌面，另一只手固定一側(cè)前肢，讓未固定的一側(cè)前肢接觸桌面。待該前肢自動(dòng)移動(dòng)時(shí)，開始計(jì)時(shí)。記錄從開始邁步到回到鼠籠所需要的總時(shí)間。同時(shí)記錄走過整個(gè)斜面的步數(shù)。然后，用斜面的長度除以步數(shù)即為步長。檢測(cè)順序?yàn)橄茸髠?cè)后右側(cè)，并重復(fù)2次。
 
步態(tài)調(diào)整試驗(yàn)：研究人員用上述相同的方法固定大鼠后，向側(cè)前方慢慢移動(dòng)大鼠，使其在5秒鐘內(nèi)走完90 cm距離，記錄大鼠所用的步數(shù)。然后再向側(cè)后方移動(dòng)大鼠，記錄步數(shù)。檢測(cè)順序?yàn)橄扔覀?cè)后左側(cè)。每天重復(fù)2次。正常大鼠對(duì)這種被動(dòng)運(yùn)動(dòng)的反應(yīng)是被檢前爪出現(xiàn)一系列的調(diào)整步態(tài)，6-OHDA損傷大鼠健側(cè)前爪這種步態(tài)調(diào)整的次數(shù)明顯減少，而損傷一側(cè)前爪往往不受影響。
 
熟練運(yùn)用前肢的試驗(yàn): 在一有機(jī)玻璃制成的方盒內(nèi)，放置一個(gè)有7層臺(tái)階的斜梯，在斜梯的第2-5層臺(tái)階的兩側(cè)各放10粒大鼠飼料顆粒，每粒45mg重。動(dòng)物禁食2天后置于試驗(yàn)盒中，使其熟悉試驗(yàn)環(huán)境并爬梯取食。然后連續(xù)測(cè)試7天。分別記錄每次測(cè)試中大鼠抓取和吃掉的飼料顆粒數(shù)。（Deniz Kirik等，1998）
 
（3）其它檢測(cè)
病理學(xué)和生化檢測(cè)同，完全，損傷PD模型。
注：
（1）立體定位必須準(zhǔn)確：定位的位置可參見圖譜；有不同的選擇。本文的尺寸只是其中之一
（2）為保證定位準(zhǔn)確，必須反復(fù)多次注射染料后切片，加以驗(yàn)證。
（3）6-OHDA的質(zhì)量：粉劑和配好的溶液不宜久存，原則上不能氧化為紅色。最好現(xiàn)用現(xiàn)配，正待使用的6-OHDA溶液必需置于冰上，避光，30分鐘內(nèi)用完。
 
二、機(jī)械損傷的大鼠PD模型
 
6-OHDA損毀MFB造成的大鼠PD模型有兩個(gè)明顯的弊端：一是神經(jīng)元急性死亡。6-OHDA注入后15分鐘即可檢測(cè)到DA含量的下降，在第30-60分鐘時(shí)更加明顯，3-5天內(nèi)絕大多數(shù)神經(jīng)元死亡。二是損傷嚴(yán)重。經(jīng)APO誘發(fā)旋轉(zhuǎn)7圈／分以上者，黑質(zhì)內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元的死亡率已經(jīng)超過90％?？梢娺@種模型對(duì)于研究多巴胺能神經(jīng)元慢性進(jìn)行性病變的全過程不甚理想。但由此得到啟發(fā)，人們發(fā)現(xiàn)機(jī)械損傷MFB同樣可以造成黑質(zhì)內(nèi)的多巴胺能神經(jīng)元變性壞死，并且這種變化呈現(xiàn)慢性、進(jìn)行性過程。已經(jīng)建立的造模方法有MFB軸突切斷術(shù)（medial forebrain bundle axotomy）和中腦半切術(shù)（hemitransection of midbrain）。
 
（一）大鼠MFB切斷術(shù)：
 
1．操作步驟
 
Wistar大鼠，雌性，體重185-210g。常規(guī)注射水合氯醛麻醉后，置于Kopf立體定位儀上固定。切開皮膚，暴露顱骨前囟。選擇部位在前囟后3.8mm，中線旁開2.4mm處打孔。將Kopf公司（Kopf Instruments，Tuyunga，CA，USA）生產(chǎn)的可伸縮電線刀（retractable wire knife）垂直伸入孔內(nèi)達(dá)顱骨平面下8mm處，固定外套管，將電線刀的刀刃由外套管中推出2.0-3.0mm。上提電線刀約2.5mm，然后下放回原處。再重復(fù)一次，以保證MFB充分切斷。然后回收刀刃，退出電線刀?？p合皮膚（Lapchak PA等，1993）。
 
 2．模型檢測(cè)
（1）旋轉(zhuǎn)行為學(xué)檢測(cè)：術(shù)后4周，將大鼠腹腔內(nèi)注射AMPH（5mg／kg）誘發(fā)大鼠旋轉(zhuǎn)。計(jì)數(shù)90分鐘內(nèi)的旋轉(zhuǎn)次數(shù)。
（2）其它檢測(cè)：病理和生化檢測(cè)與6-OHDA損毀模型同。

（二）中腦半切術(shù)（hemitransection of midbrain）
1．操作步驟
SD大鼠，雌雄不拘，體重200-250g。常規(guī)方法麻醉，立體定位儀上固定和暴露顱骨前后囟。在前囟后1mm，中線旁開0.5mm處打孔。將以特制的4mm寬的刀，沿與顱骨成68度角的方向，斜插入9mm，然后將刀退出?？p合皮膚。（Toffano G等，1984）
 
2．模型檢測(cè)
（3）旋轉(zhuǎn)行為學(xué)檢測(cè)：術(shù)后8周，皮下注射APO（0.25mg／kg），誘發(fā)大鼠向健側(cè)旋轉(zhuǎn)。
（4）其它檢測(cè)：病理和生化檢測(cè)與6-OHDA損毀模型相似。
注：
1．有報(bào)道表明MFB切斷后18和19天后黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元存活率分別為44％和 50％（Knusel B等，1993； Lapchak P A等，1993）此時(shí)可模擬早期PD的病理改變。
2．逆行追蹤顯示MFB切斷的成功率為92-99％。可見用該方法造模成功率高，較為經(jīng)濟(jì)。 3．MFB切斷后，黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元呈現(xiàn)漸進(jìn)性地死亡，可以模擬PD病理變化的全過程，對(duì)于研究神經(jīng)元的再生和PD的預(yù)防作用尤為合適。
4．切斷術(shù)后短時(shí)間內(nèi)，損傷的程度不嚴(yán)重，用APO難以誘發(fā)出大鼠的旋轉(zhuǎn)行為。誘發(fā)這種異常旋轉(zhuǎn)行為要在損傷后相對(duì)較長的一段時(shí)間內(nèi)（約2月以上）。
 
三、1一甲基一4苯基一1，2，3，6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP）模型
（一）MPTP及其模型簡介
MPTP的毒性作用最早不是在動(dòng)物而是在幾位年青的吸毒者上發(fā)現(xiàn)的（Longston et a1. 1983）。
 
1979～1982年期間發(fā)現(xiàn)，一群有毒癮的加利弗尼亞年輕人，因吸食新合成的海洛因而患上了嚴(yán)重的不可逆的PD，這些人出現(xiàn)了典型的PD癥狀，并且用L-DOPA及DA受體激動(dòng)劑治療有效。
 
分析新合成的海洛因時(shí)發(fā)現(xiàn)，這種海洛因不僅含有25％的1一甲基一4一苯基一4一丙酰氧基吡啶，而且還含2.9％的MPTP。隨后在不同動(dòng)物上均證實(shí)了MPTP導(dǎo)致PD的能力；生物化學(xué)和組織化學(xué)研究證明，MPTP引起的人的PD完全符合臨床所見PD所有的顯著特征；MPTP在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上可完全再現(xiàn)PD病人的各種癥狀，所以，MPTP處理的動(dòng)物可作為一種理想的PD模型（Ger1ach等， 1991; Tipton等， 1993）。
 
1. 影響MPTP毒性作用的因素
 
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的種類：外周使用MPTP可對(duì)多種動(dòng)物產(chǎn)生神經(jīng)病理學(xué)影響，包括小鼠、猴、狗、貓、羊、金魚。值得注意的是，動(dòng)物種屬對(duì)MPTP毒性作用的敏感性有明顯的差別。不同的MPTP劑量對(duì)不同的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物紋狀體DA的影響不同，如大劑量的MPTP對(duì)豚鼠僅產(chǎn)生輕微的毒性作用，為使DA降低的程度相同，大鼠、豚鼠使用MPTP的量是猴、C57／BLACK小鼠用量的50倍。種屬差異性的原岡日前仍不完全清楚，可能與MPTP的藥代動(dòng)力學(xué)、分布、主要代謝產(chǎn)物MPP+的排泄率以及神經(jīng)黑素、MAO亞型在腦內(nèi)的分布和定位、黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)DA代謝、抗氧化劑含量等不同有關(guān)（Gerlach等，1991；Tipton等，1993）。
 
個(gè)體差異：對(duì)MPTP的敏感性除有種屬差異外，還有明顯的個(gè)體差異，猴尤為突出。由于敏感性有個(gè)體差異，許多實(shí)驗(yàn)室都沒有一個(gè)制備PD模型的標(biāo)準(zhǔn)劑量，而是根據(jù)實(shí)際情況摸索適宜劑量的MPTP。同種動(dòng)物對(duì)MPTP的敏感性有個(gè)體差異的原因尚不清楚，只有少量的系統(tǒng)研究。可能的原因是：不同個(gè)體DA能神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)MPTP敏感性和功能代償機(jī)制存在差異。對(duì)猴的研究確實(shí)表明，沒有癥狀的猴紋狀體DA減少75％，而有癥狀的猴紋狀體DA減少95％以上，而且，有癥狀的猴其紋狀體以外的DA也減少，表明中腦邊緣系統(tǒng)內(nèi)DA能系統(tǒng)也受到了損傷（Pifl等，1990）。
 
動(dòng)物的年齡：因?yàn)镻D多發(fā)生于老年人，外源性和內(nèi)源性MPTP樣神經(jīng)毒素可能在發(fā)病機(jī)理上起相似的作用，所以人們提出這樣一個(gè)有趣的問題：與年輕動(dòng)物相比，是否老齡動(dòng)物對(duì)MPTP毒性作用更敏感？實(shí)際上己觀察到小鼠確實(shí)有這種年齡依賴關(guān)系，與年輕小鼠相比，老齡小鼠受損更嚴(yán)重，而且也更不容易恢復(fù)功能。通過對(duì)2～24月齡C57／BLACK小鼠的系統(tǒng)研究已證實(shí)了上述結(jié)果。在2～10月齡之間，對(duì)MPTP的敏感性明顯增加（與人從青年到成年相對(duì)應(yīng)），在10～16月齡（與人從成年到中年相對(duì)應(yīng)）之間，敏感性進(jìn)一步輕微增加，直到24月齡敏感性不再增加反而下降。在22個(gè)月的觀察期內(nèi)，未見到DA含量有劑量依賴性下降，而病人則有DA含量的下降，然而有趣的是，象MPTP敏感性一樣，MAO-B的活性也有一個(gè)年齡依賴的時(shí)程，而代謝過程中需MAO-B的MPP+的敏感性則不依賴動(dòng)物的年齡?？赡艿慕Y(jié)論是：MPP+不是最終的毒素。外周給MPTP后，分別測(cè)量NMRI、C57／BLACK小鼠、大鼠不同腦區(qū)MPTP及MPP+的含量證實(shí)了這一結(jié)論。組織中MPP+濃度看來不長DA能神經(jīng)元及去甲腎上腺素能神經(jīng)元易受MPTP損傷的決定性岡素，因?yàn)樵贛PTP損傷的腦區(qū)和非損傷腦區(qū)內(nèi)MPP+的濃度相同。這些年齡依賴性作用己在靈長類得到證實(shí)。幼年狨（6～8個(gè)月）比成年狨（2～4歲）或老年狨（8～10歲）更具抵抗力。為得到同樣嚴(yán)重程度的癥狀，幼年動(dòng)物需要MPTP的量大且用藥時(shí)間長，。才引起紋狀體內(nèi)DA大量減少。與幼年狨相比，成年或老年誠更能克服功能紊亂（Irwin等，1992；Rose等，1993； Nwanze等，1995）。
 
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的影響：除了種屬、個(gè)體差異、年齡因素外還有許多其它因素可影響MPTP的敏感性，同一劑量、不同的給藥方法（注射方式：s.c或i.p，次數(shù)，頻率）可產(chǎn)生不同的結(jié)果。
 
損毀藍(lán)班可加強(qiáng)MPTP的神經(jīng)毒作用。小鼠外周給去甲腎上腺素能神經(jīng)毒素DSP-4可加強(qiáng)MPTP的毒性反應(yīng)，松猴兩側(cè)藍(lán)斑內(nèi)注射6-OHDA同樣有加強(qiáng)作用。其它有此種影響的藥物包括：二己二硫氨基甲酸己酯（DDC），酒精，乙醛。而這些方法在小鼠的作用是有限的。所有這些藥物都是通過影響毒素代謝的酶類未增強(qiáng)MPTP的神經(jīng)毒作用，例如， DDC贅合銅，進(jìn)而使一些含銅酶如SOD。醛脫氫酶等失活，大劑量的乙醛抑制醛脫氫酶（Marien等，1993）。
 
2. 神經(jīng)毒作用
 
MPTP模型的一個(gè)主要問題是MPTP作用的持續(xù)時(shí)間。最初，根據(jù)人類PD推斷：此毒素在動(dòng)物體內(nèi)也引起持久的黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)損傷和相應(yīng)的功能紊亂。但研究結(jié)果令人像奇，因?yàn)閲X類動(dòng)物與猴相比在行為學(xué)上存在差異，即MPTP引起的動(dòng)物模型行為學(xué)改變?cè)趪X類動(dòng)物持續(xù)時(shí)間短而靈長類動(dòng)物則持續(xù)時(shí)間長。將乙醛與MPTP聯(lián)合應(yīng)用可廣泛損毀小鼠DA能系統(tǒng)，用藥一周后，盡管DA減少93％，但運(yùn)動(dòng)機(jī)能減退現(xiàn)象基本消失（Zuddas等，1992），而DA減少可持續(xù)4個(gè)月。
 
在高等靈長類動(dòng)物如狒狒和羅猴己觀察到持久的PD癥狀。給獼猻每周一次靜脈注射MPTP（0.4～0.5ml/kg）直到20個(gè)月，則表現(xiàn)為穩(wěn)定的PD癥狀，甚至在停藥16個(gè)月后仍能見到癥狀。老年羅猴（23歲以上）兩側(cè)大腦動(dòng)脈內(nèi)注射MPTP（0.mg／kg）也同樣表現(xiàn)出穩(wěn)定的PD癥狀，用藥后45天最明顯，12個(gè)月后運(yùn)動(dòng)能力仍下降95％。但以上兩個(gè)實(shí)驗(yàn)均未同時(shí)進(jìn)行神經(jīng)化學(xué)分析，因此，難以說明神經(jīng)化學(xué)與功能紊亂之間有何種關(guān)系（Smith等，1993）。
 
MPTP引起人及靈長類動(dòng)物的PD癥狀可用L-DOPA和多巴胺D2受體激動(dòng)劑治療。外周用競(jìng)爭(zhēng)性NMDA受體阻斷劑MK801不能改善猴的癥狀。相反，競(jìng)爭(zhēng)性NMDA受體阻斷劑CPP和CGP40.116可加強(qiáng)L-DOPA的作用。AMPA受體阻斷劑NBQX的作用目前尚有爭(zhēng)論。因此外周用谷氨酸受體阻斷劑對(duì)多巴胺D1、D2受體激動(dòng)劑是否具有加強(qiáng)作用一直是爭(zhēng)論的焦點(diǎn)（Starr，1995）。
 
預(yù)先給猴使用MAO-B抑制劑（如selegiline）和DA再攝取抑制劑（nomifensine），可阻斷MPTP代謝成MPP+及DA能神經(jīng)元對(duì)其的攝取，可防止MPTP對(duì)猴的神經(jīng)毒作用?？寡趸瘎┚S生素C、維生素E的神經(jīng)保護(hù)作用仍有待證實(shí)。在狨的實(shí)驗(yàn)表明，大劑量的維生素C（100mg每天）和維生素風(fēng)2350每天）對(duì)MPTP引起的紋狀體內(nèi)DA的耗竭沒有保護(hù)作用。預(yù)先使用含琉基的抗氧化劑如半胱胺或二硫基丙醇可部分地防止MPTP的神經(jīng)毒作用，聯(lián)合使用輔酶Q和尼克酚胺可防止DA輕中度耗竭。尼克酞胺或自由基清除劑S－PBN可防止MPTP引起的DA輕中度耗竭，這些結(jié)果可解釋抗氧化劑具有神經(jīng)保護(hù)作用的差異性。麥角生物堿、脂質(zhì)膜成份如神經(jīng)節(jié)苷脂（GM1〕。神經(jīng)元一氧化氮合成酶抑制劑、腦內(nèi)長期注射神經(jīng)營養(yǎng)因子如BDNF（Brain一derived neurotrophic factor）和FGF（fibroblast growth factor）。鈣通道阻斷劑如尼莫地平等也有部分保護(hù)作用。NMDA受體阻斷劑可阻斷內(nèi)向鈣離于流，但它的神經(jīng)保護(hù)作用還未得到證實(shí)。但MK801對(duì)小鼠無神經(jīng)保護(hù)作用，而NMDA受體阻斷劑CPP在靈長類動(dòng)物可防止MPTP引起的神經(jīng)元變性壞死（Gerlach等， 1991; Mihatsh等， 1991; Kupsch等，1995）。
 
3．行為學(xué)變化
 
用MPTP誘發(fā)的PD猴出現(xiàn)與人PD相似的運(yùn)動(dòng)異常，最突出的表現(xiàn)是運(yùn)動(dòng)不能和僵直。而靜止性震顫癥狀只在獨(dú)處的情況下才能見到。癥狀的嚴(yán)重程度變化很大，隨種屬、年齡和藥量而異。MPTP誘發(fā)的癥狀也可在其它動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中觀察到：羅猴，松猴、恒河猴、拂狹、誠。對(duì)猴的PD癥狀可進(jìn)行量化分級(jí)，有許多儀器裝置可用來測(cè)量動(dòng)物的自主運(yùn)動(dòng)，如用記錄遮蔽光線次數(shù)的特殊裝置的籠子，可以記錄動(dòng)物在單位時(shí)間內(nèi)的平均活動(dòng)次數(shù)（Stern， 1990：Ger1ach等，1991）。
 
MPTP損傷的小鼠，在急性中毒期表現(xiàn)的癥狀為瞳孔散大、豎毛、唾液過多、陣攣性的癲癰發(fā)作，它們可在15～30分鐘內(nèi)出現(xiàn)，但很快恢復(fù)正常，很少見到長時(shí)間的運(yùn)動(dòng)機(jī)能減退，盡管有運(yùn)動(dòng)活動(dòng)減少（-66％）。小劑量注射氟p哌啶醇（0.2ml/kg, i.p）后，可使MPTP損傷的小鼠運(yùn)動(dòng)改變非常明顯，而這個(gè)劑量的氟賑唆醇對(duì)正常小鼠是不引起任何運(yùn)動(dòng)行為改變的，但可引起MPTP損傷的小鼠明顯的軀體感覺定位功能減退，這與紋狀體內(nèi)DA含量變化相平行，可持續(xù)3～5個(gè)月。另外，MPTP損毀的動(dòng)物還表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)不能和僵直性昏厥，這些運(yùn)動(dòng)功能紊亂5個(gè)月后仍存在，這些行為學(xué)改變被歸因于MPTP引起的DA能神經(jīng)元超敏（Zuddas等，1992）。
 
4．組織病理學(xué)改變
 
有文獻(xiàn)報(bào)道了對(duì)一位因吸食海洛因而患MPTP誘發(fā)的PD患看的死后研究結(jié)果。組織病理學(xué)研究表明，MPTP選擇性破壞黑質(zhì)致密部DA能神經(jīng)元。靈長類動(dòng)物研究表明，盡管MPTP對(duì)大多數(shù)靈長類動(dòng)物黑質(zhì)神經(jīng)元有選擇性破壞，但詳細(xì)檢查仍可發(fā)現(xiàn)其它腦區(qū)也受到了影響，特別是老年動(dòng)物藍(lán)斑處神經(jīng)元減少。免疫細(xì)胞化學(xué)顯示，甚至在年輕動(dòng)物的VTA和下丘腦，TH免疫活性陽性神經(jīng)元減少，定量分析顯示，恒河猴使用MPTP累計(jì)劑量達(dá)1.75～4.59mg/kg可導(dǎo)致黑質(zhì)致密部細(xì)胞數(shù)減少46％到93％，VTA處只減少28％到57％。神經(jīng)元的減少導(dǎo)致PD癥狀的出現(xiàn)及紋狀體內(nèi)DA減少達(dá)99％以上（German等，1988：Bemocchi等，1993）。
 
Lewy小體的出現(xiàn)是PD病人特征性的病理標(biāo)志。在老年猴，與PD病人出現(xiàn)Lewy小體相同的腦區(qū)內(nèi)出現(xiàn)嗜酸性細(xì)胞包涵體，但其重要性很難判斷，因?yàn)槎呔哂胁煌男螒B(tài)學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)特征。
 
對(duì)小鼠還缺乏不同腦區(qū)神經(jīng)元受MPTP影響的系統(tǒng)研究?？筎H免疫細(xì)胞化學(xué)研究顯示，MPTP處理的C57／BLACK小鼠黑質(zhì)神經(jīng)元減少40％，VTA處神經(jīng)元減少17％，紋狀體DA減少85％，Nissl染色半定量研究也證實(shí)了這一結(jié)果，并且證實(shí)藍(lán)斑和下丘腦的神經(jīng)元也受到了損傷（Date等，1990）。
 
5．神經(jīng)化學(xué)變化
 
MPTP可引起靈長類和嚙齒類動(dòng)物一系列神經(jīng)化學(xué)變化。紋狀體和蒼白球內(nèi)DA及代謝產(chǎn)物濃度降低，TH活性降低，DA重?cái)z取位點(diǎn)減少等都表明黑質(zhì)紋狀體DA能系統(tǒng)受到了損害。與組織學(xué)改變相似，這些變化并不局限在黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)，大腦皮層及邊緣區(qū)也發(fā)現(xiàn)去甲腎上腺素濃度降低（如運(yùn)動(dòng)皮層減少79％，運(yùn)動(dòng)輔助區(qū)減少78％，額葉皮層63～75％，嗅皮層減少59％，Ammon氏角減少69％）。與DA相比，去甲腎上腺素（NA）、5HT。神經(jīng)肽受MPTP的影響較小。用MPTP處理的誠，其甲硫腦啡肽、亮氨酸腦啡肽、膽囊收縮素（CCK）。P物質(zhì)、神經(jīng)降壓素的濃度至少在基底核是沒有變化的（Pifl等，1991）。